تحقیق درباره ژل الکتروفورز

تحقیق درباره ژل الکتروفورز

تحقیق ژل الکتروفورز در قالب فایل ورد تهیه و طراحی شده و شامل صفحه فهرست بندی موضوعات، عنوان تحقیق،مقدمه، متن تحقیق و منابع می باشد که مجموع صفحات این فایل 12 صفحه است.

صفحات این تحقیق شماره گزاری شده و متن آن نیز پاراگراف بندی و ویرایش شده است و آماده ارائه و یا پرینت می باشد. فایل ورد این تحقیق قابل ویرایش بوده و شما می توانید به مطالب آن افزوده و یا هر قسمت که بخواهید حذف کنید.

جهت جلوگیری از بهم ریختگی متون و نمایش صحیح در دستگاه ها و نرم افزار های مختلف علاوه بر فایل Word یک نسخه فایل PDF هم در فایل دانلودی قرار داده شده است.

عناوین و سرفصل ها:

مقدمه – کاربردهای تکنیک ژل الکتروفورز – انواع الکتروفورز – ژل آگاروز / آگارز ( Agarose) – ژل پلی آکریلامید (PolyAcrylamid) – تهیه ژل برای انجام الکتروفورز – طرز تهیه ژل آگاروز – مواد لازم برای تهیه بافرها – طرز تهیه ژل پلی آکریلامید – الکتروفورز مولکول‌های DNA – الکتروفورز پروتئین‌ها با استفاده از الکتروفورز به روش PAGE – منابع

بخشی از تحقیق:

مقدمه

الکتروفورز ژل (انگلیسی:  Gel electrophoresis) روشی برای جداسازی و تجزیه و تحلیل ماکرومولکول‌ها (DNA , RNA  و پروتئین‌ها) و قطعات آنها با توجه به اندازه و بار آنها است. در شیمی بالینی برای جداسازی پروتئین‌ها توسط بار یا اندازه استفاده می‌شود و در زیست‌شیمی و زیست‌شناسی مولکولی برای جدا کردن جمعیت ترکیبی از قطعات DNA و RNA نسبت به طول، همچنین برای برآورد اندازه قطعات DNA و RNA یا جدا کردن پروتئین‌ها با بار استفاده می‌شود.

مولکولهای اسید نوکلئیک با استفاده از یک میدان الکتریکی از هم جدا می‌شوند تا بتوانند مولکولهای با بار منفی را از طریق ماتریس آگارز یا سایر مواد منتقل کنند. مولکولهای کوتاهتر سریعتر حرکت می‌کنند و دورتر از سلولهای طولانی‌تر مهاجرت می‌کنند زیرا مولکولهای کوتاهتر با سهولت بیشتری در منافذ ژل حرکت می‌کنند. این پدیده غربال نامیده می‌شود. همچنین تکنیک ژل الکتروفورز می‌تواند به منظور جداسازی نانوذرات مورد استفاده قرار بگیرد.

از جمله کاربردهایی که ژل‌ها در هنگام الکتروفورز بر عهده دارند، مهار نمودن کنوکسیون دمایی ایجاد شده در اثر میدان الکتریکی، غربالگری و نیز ایجاد تأخیر در حرکت مولکولها می‌باشد. ژل الکتروفورز DNA معمولاً به منظور تجزیه و تحلیل بعد از تکثیر DNA با استفاده از تکنیک PCR به کار می‌رود، اما ممکن است به عنوان یک تکنیک جهت آماده‌سازی برای تکنیکهای دیگر مانند اسپکترومتری جرمی، RFLP , PCR، کلونسازی، تعیین توالی DNA یا ساترن بلاتینگ مورد استفاده قرار بگیرد.

اساس کار این تکنیک اعمال جریان الکتریکی است که منجر به جداسازی و شناسایی مولکول ها میشود . همان گونه که در بالا شرح دادیم کاربرد این روش  در آزمایشگاه های مولکولی و بیوشیمی برای جداسازی مولکول‌های باردار مانند RNA ،DNA  و پروتئین است. ژلی که برای این تکنیک استفاده میشود از پودر آگاروز ( آگارز) و یا پلی آکریلامید است . ساختار این ژل ها منفذ دار است و همین امر موجب میشود ، مولکول‌ها با اندازه‌های متفاوت به راحتی از آن عبور کند. برای کوچک یا بزرگ کردن این منافذ جهت حرکت مولکول های کوچکتر و یا بزرگتر ، میتوانیم غلظت ژل های مورد استفاده درالکتروفورز را کمتر و یا بیشتر کنیم.

کاربردهای تکنیک ژل الکتروفورز

کاربرد اصلی این متد در آزمایشگاه ها به دو بخش اصلی تقسیم میشود :

• جداسازی مولکولهای DNA که یا بصورت استخراج شده هستند و یا محصول PCR ، ریل تایم و یا کلونیگ ژن
• بررسی و مطالعه کیفیت محصول PCR

منافذ بزرگ  ژل آگاروز قطری حدود ۱۰۰ تا ۵۰۰ نانومتردارد که کاملا متناسب برای جداسازی  مولکول‌های DNA با طول بالا میباشد. البته این تکنیک  برای جداسازی پروتئین‌ها نیز میتواند بسیار ایده آل باشد ، اما روش رایج شناسایی پروتئین‌ها ،  کروماتوگرافی است. اما توجه داشته باشید که تکنیک ژل الکتروفورز نیز بعنوان یک متد ساده و اقتصادی میتواند برای شناسایی پروتئین ها کاربرد داشته باشد. در اصطلاح آزمایشگاهی روش الکتروفورز ژل پلی آکریلامید که منافذی با قطر 10 تا 200 نانومتر دارد برای جداسازی پروتئین‌ها بسیار ایده آل است.به این روش PAGE نیز گفته میشود مبنای آن بر اساس سایز پروتئین ها است.

انواع الکتروفورز

عملکرد الکتروفورز  به دو روش عمودی یا افقی میباشد که هر یک کاربردهای مخصوص به خود را دارد.

از تفاوت های آشکار این دو جهت قرارگیری ژل است :

در الکتروفورز افقی، ژل مورد استفاده آگاروز است و نیز قرارگیری ژل به صورت افقی در محیط بافر است،

الکتروفورز عمودی ، ژل مورد استفاده پلی آکریلامید است  و قرارگیری ژل به صورت عمودی و درون محفظه الکتروفورز است و تماس آن با بافر محدود است.

(توجه داشته باشید که در روش عمودی ، نمیتوان از ژل آگاروز استفاده کرد و فقط از ژل پلی آکریلامید استفاده میشود چون در پلیمریزه شدن آن ، اکسیژن بعنوان یک مهارکننده فعالیت دارد. در الکتروفورز افقی ژل در ارتباط مستقیم با اکسیژن است. بنابراین از الکتروفورز عمودی که تماس آن با اکسیژن محدود است استفاده میکنند.

در اینجا به تفاوتهای اصلی دو ژل پلی آکریلامید و ژل آگاروز میپردازیم:

ژل آگاروز / آگارز ( Agarose)

• از پلی ساکارید جلبک های دریای تهیه میشود.
• درون کاست افقی شکل میگیرد.
• برای استفاده، ایمن است.
• قادر به جداسازی مولکول های بزرگ است.
• ایده آل برای جداسازی DNA است.
• دارای منافذ بزرگ است.
• ساختار ساده ای دارد.

ژل پلی آکریلامید (Poly‌Acrylamid)

• از اتصالات عرضی پلیمر آکریلامید درست میشود.
• درون کاست عمودی شکل میگیرد.
• سمی و خطرناک است.
• قادر به جداسازی مولکول های کوچک نیز است.
• برای جداسازی پروتئین و DNA کاربرد دارد.
• دارای منافذ کوچک است.
• ساختار سخت و پیچیده ای دارد.

تهیه ژل برای انجام الکتروفورز

همانطور که گفته شد با توجه به تکنیک مورد نظر از از آگاروز و یا پلی آکریلامید استفاده میشود. این مواد بصورت پودر در اختیار کاربر قرار میگیرد و پس از مخلوط با بافرهای مخصوص و حرارت دادن به یک مایع شفاف تبدیل میشود. بر    اساس غلظت مورد نظر ، مقدار مشخصی از پودر  را در بافر TAE  و یا TBE مخلوط و حل میکنند. سپس مایع شفاف به دست آمده را درون کاست ژل و در محفظه ای بنام  تانک الکتروفورز ریخته و  توسط شانه چاهک ،چاهک‌هایی برای قراردادن نمونه آماده می‌شود . مایع بعد از خنک شدن، بصورت ژل بسته شده و خنک میشود.

خاصیت بافر درون تانک الکتروفورز ، آسان کردن عبور جریان از ژل است . این  تانک با  دو الکترود به یک منبع الکتریکی برای ایجاد جریان الکتریکی متصل می‌شود.

برای مشاهده نمونه‌ها روی ژل، هنگام قرار دادن آن‌ها درون چاهک،از رنگ‌های قابل مشاهده با نور UV مانند DNA safe stain  استفاده میشود.البته در گذشته، از اتیدیوم بروماید برای رنگ‌آمیزی استفاده می‌شد، اما به دلیل سمی و جهش‌زا بودن آن ها، کار با آن‌ها در آزمایشگاه ها ممنوع اعلام شد. پس از پایان حرکت مولکول‌ها به سمت قطب مخالف، جریان الکتریکی قطع می‌شود و ژل توسط دستگاهی به نام ژل داک تصویربرداری میشود.

طرز تهیه ژل آگاروز

غلظتی که برای ژل آگاروز در نظر گرفته میشود معمولا بین 0.7 تا 2 درصد میباشد که بر اساس  اندازه مولکول های مورد نظر ساخته میشود. درصورتیکه  هدف از الکتروفورز فقط جداسازی و شناسایی کیفی مولکول‌ها باشد ، پیشنهاد برتر برای تهیه ژل، آگاروز است.

برای ساخت ژل با غلظت 2%، دو گرم از پودر آگاروز را  در ۱۰۰ میلی‌لیتر از بافر  TAE  یا TBE حل می‌کنیم. توجه کنید که تانک الکتروفورز را با همان بافری که برای تهیه ژل استفاده میکنید ، پر کنید. این مخلوط با حرارت دادن تبدیل به مایع شفاف و یکنواختی میشود. حرارت باعث حل شدن تمام ذرات آگاروز در بافر می‌شود. همانطور که قبلا اشاره کردیم ، ژل آگاروز بیشتر در الکتروفورز افقی استفاده می‌شود.